植物色素中有一种吡咯衍生物类,广泛存在绿色植物叶绿体中,包括叶绿素a和叶绿素b。
1.紫外分光光度(UV)法
样品制备
取新鲜植物叶片(避开叶脉),剪碎成约0.1g,迅速称重(精确至0.001g)。加入少量石英砂和碳酸钙(中和有机酸),研磨成匀浆。
提取叶绿素
加入5mL 80%丙酮(避光操作),继续研磨至组织变白。将匀浆转移至离心管,用丙酮冲洗研钵,定容至10mL。避光静置10分钟或离心(4000rpm, 10min),取上清液。
测定吸光度
用分光光度计分别测定提取液在663nm(叶绿素a)、646nm(叶绿素b)和470nm(类胡萝卜素)下的吸光度(OD值)。以80%丙酮为空白对照。
2.高效液相色谱法(HPLC)
样品提取:
准确称取液氮研磨粉末样品0.5g(精确到0.0001g)试样于15mL棕色离心管,加入5mL 3:1甲醇:四氢呋喃溶液,放置振荡器充分振荡混匀1min,置于恒温振荡器室温提取4h。结束后,转移上清于另一离心管。重复提取2次,合并2次上清液定容至10ml,氮吹干,0.5mL甲醇复溶,振荡混匀,取上清过0.22μm 滤膜,待液相色谱测定。
测试条件:
检测器:VWD
C18色谱柱:250*4.6mm*5μm
柱温:25℃
波长:665 nm(叶绿素 a)、652 nm(叶绿素 b)
流动相:A:88%甲醇水 B:0.1%BHT-TBME溶液,梯度洗脱;或者甲醇 - 乙腈 - 水(体积比 80:15:5,含 0.1% 甲酸),等度洗脱
流速:1ml/min
进样量:10μl