多糖是生物体中广泛存在的物质,是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物,它是生物体内重要的生物大分子,是维持生命活动正常运转的基本物质之一。一般是利用苯酚-硫酸法测定总多糖含量。
《中国药典》推荐方法
苯酚-硫酸法
原理:多糖水解后与苯酚生成橙黄色化合物,490nm比色测定。
特点:操作简便,但需以葡萄糖为标准品,存在换算误差。
碱性酒石酸铜滴定法
原理:多糖酸解为还原糖后滴定,结果乘以换算系数0.9。
适用场景:多糖含量>1%的样品,精度较高。
也可以按照国家推荐标准或相关行业标准测定含量
生化试剂盒法测定
试剂一:12mL× 1 瓶,4℃保存。
试剂二:无水乙醇, 自备。
试剂三:浓硫酸, 自备。
标准品:粉剂 10mg×1 支,4℃避光保存。
自备仪器和用品:
分析天平、分光光度计、台式离心机、可调式移液器、比色皿、无水乙醇、浓硫酸、蒸馏水、水浴 锅。
操作步骤:
一、总多糖提取
样本烘干粉碎,称取约 0.05g 样本,加入 1mL 水,充分匀浆。100℃水浴提取 2h(必须盖紧 盖子防止水分流失),冷却后 10000g 离心 10min ,取上清。吸取 0.2mL 上清,慢慢加入 0.8mL 无 水乙醇,混匀后 4℃静置过夜,10000g 离心 10min ,弃上清,沉淀中加入 1mL 水,充分混匀溶解 沉淀。
二、测定步骤
1 、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 490nm。
2 、称 1mg 标准 品用 1mL 蒸馏水溶解 ,浓度为 1mg/mL 。取适 当溶液配制浓度为 1mg/mL 、 0.5mg/mL 、0.25mg/mL 、0. 125mg/mL 、0.0625mg/mL 的标准品(蒸馏水进行稀释)。取 1.5mL EP 管 吸取 200µL 标准品,加入 100µL 试剂一和 0.5mL 浓硫酸,混匀后 90℃水浴 20min ,流水冷却。取 750µL 加入比色皿,于 490nm 下测定吸光值A 。根据吸光度(x )和浓度(y ,mg/mL) 做出标准曲 线。
3 、吸取 200µL 上清,加入 100µL 试剂一和 0.5mL 浓硫酸,混匀后 90℃水浴 20min ,流水冷却。 取 750µL 加入比色皿,于 490nm 下测定吸光值 △A。
三、总多糖含量计算
根据标准曲线,将样品△A 带入公式中(x ),计算出样品浓度 y(mg/mL)。 (1) 按样本鲜重计算
总多糖(mg /g 干重)=5y÷W
V 样总:上清液总体积,mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02 mL;W:样品质量,g ;样本体积已被稀释五倍,T。
注意事项:
1. 如果样品吸光值A 大于 最大浓度标准品吸光值,需要将样本用蒸馏水稀释,计算公式中再乘以相应 稀释倍数。
2. 由于浓硫酸具有强腐蚀性,请谨慎操作