液相测黄酮类（以槲皮素为例）物质，方法开发过程主要包括检测器、流动相、梯度洗脱、柱温等过程。
水（H2O）是极性分子，槲皮素含有5个羟基（-OH），羟基（-OH）是强亲水基团，能与水分子形成氢键。能和水结合，但槲皮素有2个苯环（A环和B环）通过含氧吡喃环（C环）连接，2个苯环和1个含氧杂环组成共轭平面，这种平面性使得分子间通过π-π堆积作用紧密排列，形成强分子间范德华力，阻碍水分子渗透，因此具有较大的疏水区域。它的疏水性大于亲水性，整体上又表现为非极性的特点。几乎不溶于水，可溶于乙醇，冰醋酸等有机溶剂。常见的基团极性强弱顺序，羧基（-COOH）＞羟基（-OH）＞氨基（-NH2）＞羰基（C=O）＞烷基（-CH3）。
可以用反相色谱柱C18来吸附槲皮素分子，甲醇是极性溶剂，可通过氢键和槲皮素的羟基相互作用，也可以通过范德华力溶解其非极性部分。极性水分子与槲皮素羟基（-OH）的氢键结合能力弱于有机溶剂（如甲醇）的极性匹配结合，用甲醇来作为流动相的有机相来洗脱样品组分中的槲皮素分子是相对不错的选择。
1.槲皮素在紫外-可见光区（200-400nm）呈特征吸收峰，通过DAD检测器全波长扫描，通过3D光谱图直接读取槲皮素的较大的吸收波长，比如256nm、280nm等。结合保留时间和光谱匹配，验证它是真正的特征吸收波长。
2.用常规的反相C18色谱柱，250*4.6mm*5μm，与之匹配的是进样量10-20ul（看样品的浓度和杂质情况），流速1ml/min（根据出峰的保留时间和峰形，进行微调）。它们和色谱柱的填料、柱体积等都有直接的关系。柱温可以设置为30℃左右，温度会影响到样品组分的传质效率和流动相的速率（或泵的压力），不影响样品组分的正常洗脱为准。
3.槲皮素有5个羟基，如果有部分或全部去质子化，就会发生不同程度的电离。因此，我们要做到流动相的pH值在让它们全部都不能电离，从而让槲皮素分子更稳定，HPLC测定出更对称的峰形。一般在强酸条件下（pH2.0-4.0）槲皮素是非常稳定的，采用0.1%左右的磷酸水（pH大概在2.0-2.5）作为无机相。
4.洗脱梯度，初始比例用5%-10%的有机相（如甲醇），另外一部分就是90%-95%水相（含0.1%磷酸）。这样，可以将一些易溶于水的组分先洗脱出来。从低比例开始洗脱，可以更清晰的提高组分的分离度。如果样品中除了槲皮素，还要测其他组分，是可以选用从5%开始的。同时，也可以减少溶剂效应。一般选择0-10min作为初始时间段，到10min-20min的时候可以降低水相比例到中位（50%-60%），有机相则为40%-50%。这个阶段如果有其他组分，可以再进行分段。
5.一般梯度洗脱程序会在40分钟左右，如果分析时间太长就要考虑调整有机相比例。有机相主要是从样品组分中洗脱槲皮素，在20min-30min的时候，可以考虑将有机相的比例提高到较高的比例，比如75%-80%有机相。为什么要提高到这个比例呢，根据经验如果这个比例太高，保留时间会缩短，如果太高会导致槲皮素和相邻峰的分离度不够。如果要保持分离度R＞1.5，也是调整有机相比例的关键考虑因素。
6.梯度洗脱即将结束的时候，30-40min的阶段，要将甲醇和0.1%磷酸水的比例恢复到初始的状态。比如初始90%的0.1%磷酸水和10%甲醇，现在也要调整到90%的0.1%磷酸水和10%甲醇，并持续5-10min。