植物叶片中的脱落酸(简称ABA)是一种具有倍半萜骨架的植物激素,含有羧基(-COOH)、羟基(-OH)、α,β-不饱和羰基(C=O与C=C共轭),具有紫外吸收的特征。脱落酸的等电点pKa≈4.87,如果用液相色谱,缓冲盐可用磷酸盐,调pH值到3左右;如果用液相串联质谱,缓冲盐用甲酸,以维持良好的峰形。缓冲盐的浓度常在10-50mM,以保持良好的缓冲能力。
在干旱、盐碱胁迫等逆境下,植物叶片可快速合成脱落酸,关闭叶片的气孔通道,减少水分蒸腾。它的作用机制是,细胞内离子(K+、Cl-等)外流,细胞失去水分,膨压降低,气孔逐渐减小直到关闭。
取样后的植物叶片要经过液氮冷冻,避免降解。前处理的过程中,用液氮将叶片研磨成细小的粉状,细胞结构破坏,脱落酸就会从细胞液中释放出来。细胞液中的成分比较复杂,需要用80%甲醇或异丙醇等溶解脱落酸,在低温避光的环境中操作抑制酶的活性。在提取的过程中,将粉末和预冷提取液混合,超声或涡旋振荡,离心。用有机溶剂(如氯仿、石油醚)和提取液混合,通过液液萃取将脱落酸留在水相,通过氮吹浓缩,用甲醇或乙腈复溶,0.22um膜过滤。
HPLC采用反相C18色谱柱,用甲醇-水或乙腈-水为流动相,0.1%甲酸改善峰形,梯度洗脱。流速1ml/min,柱温30-35℃(储存条件下4℃,样品在色谱柱的停留时间很短)。LC-MS/MS测定脱落酸,采用负离子模式进行检测。脱落酸的分子结构中含有羧基(-COOH),在质谱电离过程中容易失去质子形成带负电的离子,在负离子模式下能获得更高灵敏度和稳定的信号。液相部分采用乙腈和0.1%甲酸水为流动相,梯度洗脱(从高比例水相开始,逐步降低,然后恢复初始流动相),用粒径更小、更短的色谱柱(2.1*100mm,1.7um),分离度高,分析时间短。
电喷雾电离(ESI)电压-4500V,温度450℃。采用多反应监测模式(MRM),选择脱落酸定量离子对(263/153),定性离子对(263/219或204)。根据出峰的情况,调节气帘气、碰撞气、Gas1和Gas2压力。通过脱落酸标准品的浓度和峰面积,绘制标准曲线(5-7个点),得到回归方程,根据样品峰面积计算含量。